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二級生物安全柜是目前應用為廣泛的柜型。按照NSF49的中的規定，二級生物安全柜依照入口氣流風速、排氣方式和循環方式可分為4個級別：A1型，A2型(原B3型),B1型和B2型。所有的二級生物安全柜都可提供工作人員、環境和產品的保護。

A1型安全柜前窗氣流速度小量或檢測平均值應至少為0.38m/s。70%氣體通過HEPA過濾器再循環至工作區，30%的氣體通過排氣口過濾排除。

A2型安全柜前窗氣流速度小量或檢測平均值應至少為0.5m/s。70%氣體通過HEPA過濾器再循環至工作區，30%的氣體通過排氣口過濾排除。

二級B型生物安全柜均為連接排氣系統的安全柜。連接安全柜排氣導管的風機連接緊急供應電源，目的在斷電下仍可保持安全柜負壓，以免危險氣體泄漏如實驗室。其前窗氣流速度小量或檢測平均值應至少為0.5m/s(100fpm)。B1型70%氣體通過排氣口HEPA過濾器排除，30%的氣體通過供氣口HEPA過濾器再循環至工作區。B2型為百分之百全排型安全柜，無內部循環氣流，可同時提供生物性和化學性的安全控制。

三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設計的，柜體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，俗稱手套箱(Golve box)，試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染，適用于高風險的生物試驗。